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试剂耗材

极敏型 ECL化学发光底物试剂盒

产品介绍【返回】

品牌: 炎熙
货号: ECL-F-100/500
供应商: 上海觅拓
规格: ECL-F-100/ECL-F-500
规格: ECL-F-100 产品价格: ¥328.0
规格: ECL-F-500 产品价格: ¥1288.0
试剂盒组成:
货号 组份 数量 价格
ECL-F-100 A 液 50mL 328元
B 液 50mL
说明书 1 份
ECL-F-500 A 液 250mL 1288元
B 液 250mL
说明书 1 份
 
 
储存:建议置于4 ºC避光保存,一年稳定。
 
一、产品简介
本试剂盒是非放射性发光系统,用于检测固定在膜上的蛋白或核酸,灵敏度高,背景低,最低检测灵敏度可达低飞克(femtogram)级乃至飞克级以下,适用于检测极痕量蛋白或核酸。发光信号持续时间较长,半小时以后仍可维持75%的发光,便于反复曝光操作。与其他 ECL 化学发光底物相比,可显著减少样本及一抗和二抗的使用量。
 
二、原理:
极敏型ECL化学发光底物试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶(HRP)的抗体、抗原或者核酸。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上,以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸,洗膜后置于本产品配制的ECL工作液中,室温孵育数分钟,HRP使工作液中的鲁米诺(Luminol)氧化并发光,试剂中添加的增强配方可以使这种发光得到极大增强,从而能够检测更少量的蛋白质或核酸。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来,可清晰显示蛋白质或核酸条带。
 
三、产品优点:
低飞克级灵敏度——极高的灵敏度,能快速检测更广泛的蛋白范围,最低可检测飞克(femtogram)级以下的蛋白。
信号稳定——发光时间较长,能进行多次曝光,半小时以后仍可维持75%的发光。
信号强——发光信号比对碘苯酚增强的 HRP-鲁米诺检测体系得到极大增强。
稳定性较高——试剂盒可在4度稳定存放一年。
节约抗体——需要更少(稀释更多)的一抗和二抗,特别节省抗体(推荐用量:一抗0.01-0.2μg/mL,二抗2-10ng/mL)。
 
四、使用方法:
1. 印迹膜制备:执行常规电泳、转膜、HRP标记的抗体或者HRP标记的核酸探针孵育、洗膜;ECL工作液含有HRP催化的发光底物,检测系统必须基于HRP酶标记的抗体或者核酸探针。充分的洗涤对于降低背景非常重要,所有步骤均在室温下完成。
2. ECL工作液的配置:在使用前取等量A液和B液,混合均匀并尽快使用;将膜片置混合液中,于室温下孵育约2分钟,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片,注意不要在膜片表面形成气泡。
3.蛋白或核酸信号显现:
1). 用平头镊钳住膜片,垂直置于吸水纸上以吸去过量试剂,仅留下少量液体覆盖表面,不可让膜完全干燥;
2). 将膜片置于保鲜膜上,吸附蛋白面朝上,小心赶尽气泡;
3). 用电子装置感光,或在暗室中用X光片曝光;
4). 根据信号的强弱适当调整曝光时间,也可选择不同时间多次曝光,以达最佳效果。
 
五、安全性:
无特殊毒性,按普通化学品处理。如果不慎与眼、皮肤和衣物接触,请立刻用大量清水冲洗。
 
六、注意事项:
1.由于不同品牌的抗体质量不同,以及抗体的保存条件和保存时间的不同,初次使用时建议对抗体用量进行优化,以取得最优效果。
2.勿将ECL化学发光底物试剂盒暴露在阳光或强光下,否则会导致其失活;建议保存在棕色瓶中,并避免长时间暴露在阳光下,实验室光照对试剂盒影响不大;除了X光胶片曝光和洗片处理外,所有步骤均不必在暗室中操作。
3.使用充足的洗涤缓冲液、封闭液、抗体稀释液和底物工作液去覆盖印迹膜,以确保印迹膜处于湿润状态;使用大量的封闭液和洗涤液能减少非特异性信号的产生。
4.使用前配制ECL工作液,体积足够覆盖膜片即可;取A液和B液时一定要用不同的枪头,互相污染可能导致缓慢失活;配制完毕建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低;弃去使用过的混合试剂。
5.印迹膜与ECL工作液孵育后约3 min时发出的荧光最强,随后荧光会随着时间的延长而缓慢减弱,至30min仍可保持约75%的光信号;蛋白点荧光较弱时可以适当延长曝光时间;使用过少的ECL工作液不利反应进行,为达节约目的可将膜剪小,但勿降低ECL工作液使用比例。
6.使用生物素/亲和素体系时,避免使用脱脂奶粉作为封闭液,因为脱脂奶粉中含有多种内源性生物素,容易产生非特异性信号。
7. 避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜,相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。
8. 金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点,避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子,建议使用塑料的平头镊子。
9.叠氮化钠(NaN3)能抑制HRP活性,应避免使用NaN3,如必须使用,浓度不要超过0.01%。
10. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;戴手套可以避免在膜上留下手印,保持膜的干净。
11.本产品仅供研究使用。


常见问题:
 
问题 可能原因 解决方案
胶片反相(白色条带,黑色背景)  

体系中HRP过量
 

将HRP标记物稀释10倍以上
印迹膜上出现棕色或黄色条带
膜在暗室中发光出强烈荧光
发光信号持续时间短于8小时
 

信号太弱或者无信号
体系中HRP过量,导致底
物消耗过快
将HRP标记物稀释10倍以上
抗原或抗体不足 提高抗原或抗体浓度
蛋白转移率低 优化电转条件
HRP或者底物活性太低 **参考下面的注释
 
 

背景过高
体系中HRP过量 将HRP稀释10倍以上
封闭不充分 优化封闭条件
封闭试剂不合适 更换封闭液
清洗不充分 延长清洗时间、次数及清洗的体积
胶片曝光过度 减少曝光时间
抗原或抗体的浓度过高 减少抗原或抗体的浓度
 
蛋白条带为点状
蛋白电转失败 优化电转条件
膜未平衡 按说明书将膜平衡
膜和胶片之间有气泡 曝光之前去除气泡
出现非特异性条带 体系中HRP过量 将HRP标记物稀释10倍以上
SDS引起的非特异性结合 Western blot 过程中避免使用SDS
                            **检测底物的活性:准备1-2mL底物工作液,于暗室中加入1μL稀释的HRP结合物,工作液将会立马发出荧光,随后荧光淬灭。
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